固定化技术的应用
随着固定化技术的发展，固定化技术已经医药、食品、轻工、环保及化合物分离纯化等方面广泛应用，主要包括：
1. 通过固定化技术制备固定化酶，在医药、食品、轻工、环保等领域广泛应用。
2. 通过固定化技术制备固定化微生物细胞、固定化动物细胞、固定化植物细胞和固定化原生质体，用于酶、色素、香精、药物、疫苗、抗体、激素等各种物质的生产。
3. 通过固定化技术将母体与配基结合，制备亲和层析剂，用于化合物的亲和层析分离等。
一、固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特点，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点。
（1）酶的稳定性增加，减少温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。
（2）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
（3）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。
故此，固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。这里主要介绍固定化酶在工业生产以及酶传感器方面的应用。
1. 固定化酶在工业生产中的应用
现已用于工业化生产的固定化酶主要有下列几种：
（1）氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE—葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，
固定化酶的特性
将酶固定化制成固定化酶以后，可以基本保持酶的空间结构和活性中心的完整性，所以能够在一定的空间范围内进行催化反应，但是由于受到载体的影响，酶的结构发生了某些改变，从而使酶的催化特性发生某些变化。
在固定化酶使用过程中必须了解其特性并对操纵条件加以适当的调整。现将固定化酶的主要特性介绍如下。
一、稳定性
固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：
1. 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。
2. 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。
3. 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
4. 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。
二、最适温度
固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。例如，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5~10℃；以公家结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5~15℃。同一种酶，在采用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度比游离酶的最适温度提高12℃；用DEAE-纤维素固定化的氨基酰化酶，其最适温度比游离酶提高7℃；而烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。由此可见，固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响，在使用时要加以注意。
三、最适pH
酶经过固定化后，其作用的最适pH往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。
1. 载体性质对最适pH的影响
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。一般说来，用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH高；用带正电荷的载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶的最适pH低；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。
2. 产物性质对最适pH的影响
酶催化作用的产物的性质对固定化酶的最适pH有一定的影响。一般说来，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH低一些；产物为中性时，最适pH一般不改变。这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的pH，为此，固定化酶的最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH要低一些。
四、底物特异性
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。对于那些作用于小分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固定化酶的底物特异性与游离酶的底物特异性相同。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。例如，胰蛋白酶既可作用于大分子的蛋白质，又可作用于小分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右；以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的50%~60%。
固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而相对分子质量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。
酶固定化方法
固定化方法多种多样，主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等，这些方法都可以用于固定化酶的制备，固定化细胞通常采用吸附法或包埋法制备，原生质体固定化一般只采用包埋法制备，现分述如下。
一、吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使其固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。可以根据酶或细胞的特点，载体来源和价格，固定化技术的难度，固定化酶或细胞的使用要求等进行选择。
例如，酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多孔陶瓷和多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域广泛使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，以降低废水中的化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可吸附缠绕在多孔塑料、金属丝网等载体上，用以生产某些有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢；动物细胞大多数属于贴壁细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质的生产。
大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。此法操纵简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空纤维等。
转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操纵容易，但比表面积较小，细胞的生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，从而提高生成能力。
微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100~200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡萄糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。自1967年，Wezel首先以DEAE—Sephadex制成微载体以来，这方面的研究和应用迅速发展。现在国际上已有多种商品微载体出售，例如瑞典的Cytodex、美国的Superbeads和Veltragel等。
微载体已用于多种动物细胞的固定化。用于生产β—干扰素、人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。
微载体具有很大的比表面积，S/V达到150，即每1cm3的微载体其表面积达到150cm2，比转瓶的比表面积打几百倍，对细胞的生长和物质传统非常有利。缺点是固定化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。
中空纤维由聚丙烯、规划聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁，培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空纤维起着相当于体内微血管的作用，对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜。字1972年Knazek首先研制成功中空纤维培养器，用于动物细胞固定化以来，已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化，以生产各种单克隆抗体和疫苗等。中空纤维培养器的缺点是中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物细胞附着，也适用于悬浮细胞培养。
吸附法制备固定化植物细胞，是将植物吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用中空纤维制备固定化植物细胞和动物细胞，有利于动植物细胞的生长和代谢，具有较好的应用前景，但成本较高而且难于大规模生产应用。采用吸附法制备固定化酶活固定化细胞，操纵简便，条件温和，不会引起酶或细胞变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶或细胞与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用后受到一定的限制。
二、包埋法
将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法称为包埋法。
包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。
1. 凝胶包埋法
以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法称为凝胶包埋法。
凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法，适用于多种酶、微生物、动物细胞、植物细胞和原生质体的固定化。
酶分子的直径一般只有几十埃，为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄露出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物向外扩散都是不利的。所以凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。而在细胞核原生质体固定化中，凝胶包埋法是应用最广的方法。各种凝胶由于特性不同，它们的具体包埋方法和包埋条件也不一样。
凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。现把一些主要凝胶的包埋方法介绍如下：
（1）琼脂凝胶包埋法：将一定量的琼脂加到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55℃，加入一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热将混悬液分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化胶粒，分离后洗净备用。也可将混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化胶层切成所需的形状。由于琼脂凝胶的机械强度较差，而且氧气、底物和产物的扩散较困难，故其使用受到限制。
（2）海藻酸钙凝胶包埋法：称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化胶粒。
用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产研究。作者等人用4%的海藻酸钠溶液与等体积的黑曲霉袍子悬液混合，滴到1%的氯化钙溶液中，制成直径约1mm的固定化黑曲霉细胞，用于糖化酶的发酵生产，取得显著效果，糖化酶的产率比游离细胞高30%，固定化细胞可连续使用30天。
海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操纵简便，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。但磷酸盐会破坏凝胶结构，在使用时应控制好培养基中磷酸盐的浓度，并要在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。
（3）角叉菜胶包埋法：将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解、灭菌后，冷却至35~50℃，与一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液混匀，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中，制成小球状固定化胶粒。也可按需要制成片状或其他形状。
角叉菜胶还可以用钾离子以外的其他阳离子，如铵离子、钙离子等，使之凝聚成型。
角叉菜胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定。
角叉菜胶包埋法操纵简便，对酶、细胞核原生质体无毒害，通透性能较好，是一种良好的固定化载体。自1977年以来，在固定化细胞核固定化菌体方面方法应用。坐着等人采用角叉菜胶为载体，制备固定化枯草杆菌细胞，用于连续生产α—淀粉酶的研究，取得可喜成果。
（4）名叫包埋法：配制一定浓度的明胶悬浮液，加热溶化、灭菌后，冷却至35℃以上，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，冷却凝聚后做成所需形状。若机械强度不够时，可用戊二醛等双功能试剂交联强化。由于明胶是一种蛋白质，明胶包埋法不适用于蛋白酶以及产生蛋白酶的细胞和原生质体的固定化。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法：先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀 ，然后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合，获得所需形状的固体化胶粒。
（6）光交联树脂包埋法：选用一定分子量的光交联树脂预聚物，例如相对分子质量为1000~3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃左右使之溶解，然后与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外光照射3min左右，即可交联固定化，然后在无菌条件下，切成一定形状。
光交联树脂包埋法制备固定化酶和固定化细胞是行之有效的方法，通过选择不同分子量的预聚物可以改变聚合而成的树脂孔径，适合于多种不同直径的酶分子和细胞的固定化；光交联树脂的强度高，可连续使用较长时间；用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短，对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有明显的影响。
2. 半透膜包埋法
半透膜包埋法是将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径小些，固定化的酶不会从小球中漏出来。但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜，而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物却无法进出。故此，半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。例如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶。过氧化氢酶等。
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。制备时，一般是将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊之中。例如，将欲固定化的酶及亲水性单体溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将这两种不相溶的液体混合在一起，加入乳化剂进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的己二胺与疏水性的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加进吐温—20，使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊型的固定化酶。
利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，便形成微囊型固定化动物细胞。半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变。微囊的直径为1~2mm。其制备过程现在一般采用海藻酸钙—聚赖氨酸包埋技术。操纵时，动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋，制成直径1~2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解，便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。
三、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。
1. 离子键结合法
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE—纤维素、TE—AE—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶等。
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。例如，将处理成—OH-型的DEAE—葡萄糖凝胶加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE—葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处理过的DEAE—葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处理，使之成为—OH型，用无离子水冲洗，再用pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液，在37℃的条件下，让酶慢慢流过离子交换柱，就可制备成固定化氨基酰化酶。此固定化酶用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生产L—氨基酸。
用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失较少，但由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制好pH、离子强度和温度等操作条件。
2. 共价键结合法
通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡萄糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。
酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、羧基。巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。
使载体活法的方法很多，主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等。
（1）重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝基反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，例如，对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应。
R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2→R—O—CH2—C6H4—N+=N+H20
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成。
NaNO2+HCl=HNO2+NACl
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
（2）叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。例如，羧甲基纤维素的叠氮衍生物。
其中，亚硝酸由亚硝酸钠与盐酸反应生成。
羧甲基纤维素的酰肼衍生物可由羧甲基纤维素制备得到。其反应分两步进行，首先是羧甲基纤维素与甲醇反应生成羧甲基纤维素甲酯。
然后羧甲基纤维素甲酯与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物。羧甲基纤维素叠氮衍生物中活泼的叠氮基团可与酶分子中的氨基形成肽键，使酶固定化。
此外叠氮基团还可以与酶分子中的羟基和巯基等反应，而制成固定化酶。
（3）溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶和葡萄糖凝胶等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。
活化载体上的亚氨基碳酸基团在微碱性的条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。
（4）烷基化法：含羟基的载体可用三氯—均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。
活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基和羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。
用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操纵复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性，现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶。偶联凝胶有多种型号，如溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B，活化羧基琼脂糖凝胶4B等等，在实际应用时，选择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简便地制备固定化酶。在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使用条件，另一方面要了解酶的结构特点，要避免酶活性中心上的基因被偶联而引起失活，也要注意酶在与载体偶联后可能引起酶活性中心的构象变化而影响酶的催化能力。
四、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。
用戊二醛交联时采用的pH一般与被交联的酶或蛋白质的等电点相同。
交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基因被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方法广泛采用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。
五、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60~65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。
固定化技术的应用
随着固定化技术的发展，固定化技术已经医药、食品、轻工、环保及化合物分离纯化等方面广泛应用，主要包括：
1. 通过固定化技术制备固定化酶，在医药、食品、轻工、环保等领域广泛应用。
2. 通过固定化技术制备固定化微生物细胞、固定化动物细胞、固定化植物细胞和固定化原生质体，用于酶、色素、香精、药物、疫苗、抗体、激素等各种物质的生产。
3. 通过固定化技术将母体与配基结合，制备亲和层析剂，用于化合物的亲和层析分离等。
一、固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特点，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点。
（1）酶的稳定性增加，减少温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。
（2）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
（3）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。
故此，固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。这里主要介绍固定化酶在工业生产以及酶传感器方面的应用。
1. 固定化酶在工业生产中的应用
现已用于工业化生产的固定化酶主要有下列几种：
（1）氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE—葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，
固定化酶的特性
将酶固定化制成固定化酶以后，可以基本保持酶的空间结构和活性中心的完整性，所以能够在一定的空间范围内进行催化反应，但是由于受到载体的影响，酶的结构发生了某些改变，从而使酶的催化特性发生某些变化。
在固定化酶使用过程中必须了解其特性并对操纵条件加以适当的调整。现将固定化酶的主要特性介绍如下。
一、稳定性
固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：
1. 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。
2. 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。
3. 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
4. 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。
二、最适温度
固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。例如，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5~10℃；以公家结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5~15℃。同一种酶，在采用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度比游离酶的最适温度提高12℃；用DEAE-纤维素固定化的氨基酰化酶，其最适温度比游离酶提高7℃；而烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。由此可见，固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响，在使用时要加以注意。
三、最适pH
酶经过固定化后，其作用的最适pH往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。
1. 载体性质对最适pH的影响
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。一般说来，用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH高；用带正电荷的载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶的最适pH低；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。
2. 产物性质对最适pH的影响
酶催化作用的产物的性质对固定化酶的最适pH有一定的影响。一般说来，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH低一些；产物为中性时，最适pH一般不改变。这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的pH，为此，固定化酶的最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH要低一些。
四、底物特异性
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。对于那些作用于小分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固定化酶的底物特异性与游离酶的底物特异性相同。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。例如，胰蛋白酶既可作用于大分子的蛋白质，又可作用于小分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右；以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的50%~60%。
固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而相对分子质量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。
酶固定化方法
固定化方法多种多样，主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等，这些方法都可以用于固定化酶的制备，固定化细胞通常采用吸附法或包埋法制备，原生质体固定化一般只采用包埋法制备，现分述如下。
一、吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使其固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。可以根据酶或细胞的特点，载体来源和价格，固定化技术的难度，固定化酶或细胞的使用要求等进行选择。
例如，酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多孔陶瓷和多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域广泛使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，以降低废水中的化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可吸附缠绕在多孔塑料、金属丝网等载体上，用以生产某些有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢；动物细胞大多数属于贴壁细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质的生产。
大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。此法操纵简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空纤维等。
转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操纵容易，但比表面积较小，细胞的生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，从而提高生成能力。
微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100~200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡萄糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。自1967年，Wezel首先以DEAE—Sephadex制成微载体以来，这方面的研究和应用迅速发展。现在国际上已有多种商品微载体出售，例如瑞典的Cytodex、美国的Superbeads和Veltragel等。
微载体已用于多种动物细胞的固定化。用于生产β—干扰素、人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。
微载体具有很大的比表面积，S/V达到150，即每1cm3的微载体其表面积达到150cm2，比转瓶的比表面积打几百倍，对细胞的生长和物质传统非常有利。缺点是固定化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。
中空纤维由聚丙烯、规划聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁，培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空纤维起着相当于体内微血管的作用，对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜。字1972年Knazek首先研制成功中空纤维培养器，用于动物细胞固定化以来，已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化，以生产各种单克隆抗体和疫苗等。中空纤维培养器的缺点是中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物细胞附着，也适用于悬浮细胞培养。
吸附法制备固定化植物细胞，是将植物吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用中空纤维制备固定化植物细胞和动物细胞，有利于动植物细胞的生长和代谢，具有较好的应用前景，但成本较高而且难于大规模生产应用。采用吸附法制备固定化酶活固定化细胞，操纵简便，条件温和，不会引起酶或细胞变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶或细胞与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用后受到一定的限制。
二、包埋法
将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法称为包埋法。
包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。
1. 凝胶包埋法
以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法称为凝胶包埋法。
凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法，适用于多种酶、微生物、动物细胞、植物细胞和原生质体的固定化。
酶分子的直径一般只有几十埃，为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄露出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物向外扩散都是不利的。所以凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。而在细胞核原生质体固定化中，凝胶包埋法是应用最广的方法。各种凝胶由于特性不同，它们的具体包埋方法和包埋条件也不一样。
凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。现把一些主要凝胶的包埋方法介绍如下：
（1）琼脂凝胶包埋法：将一定量的琼脂加到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55℃，加入一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热将混悬液分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化胶粒，分离后洗净备用。也可将混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化胶层切成所需的形状。由于琼脂凝胶的机械强度较差，而且氧气、底物和产物的扩散较困难，故其使用受到限制。
（2）海藻酸钙凝胶包埋法：称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化胶粒。
用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产研究。作者等人用4%的海藻酸钠溶液与等体积的黑曲霉袍子悬液混合，滴到1%的氯化钙溶液中，制成直径约1mm的固定化黑曲霉细胞，用于糖化酶的发酵生产，取得显著效果，糖化酶的产率比游离细胞高30%，固定化细胞可连续使用30天。
海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操纵简便，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。但磷酸盐会破坏凝胶结构，在使用时应控制好培养基中磷酸盐的浓度，并要在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。
（3）角叉菜胶包埋法：将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解、灭菌后，冷却至35~50℃，与一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液混匀，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中，制成小球状固定化胶粒。也可按需要制成片状或其他形状。
角叉菜胶还可以用钾离子以外的其他阳离子，如铵离子、钙离子等，使之凝聚成型。
角叉菜胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定。
角叉菜胶包埋法操纵简便，对酶、细胞核原生质体无毒害，通透性能较好，是一种良好的固定化载体。自1977年以来，在固定化细胞核固定化菌体方面方法应用。坐着等人采用角叉菜胶为载体，制备固定化枯草杆菌细胞，用于连续生产α—淀粉酶的研究，取得可喜成果。
（4）名叫包埋法：配制一定浓度的明胶悬浮液，加热溶化、灭菌后，冷却至35℃以上，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，冷却凝聚后做成所需形状。若机械强度不够时，可用戊二醛等双功能试剂交联强化。由于明胶是一种蛋白质，明胶包埋法不适用于蛋白酶以及产生蛋白酶的细胞和原生质体的固定化。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法：先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀 ，然后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合，获得所需形状的固体化胶粒。
（6）光交联树脂包埋法：选用一定分子量的光交联树脂预聚物，例如相对分子质量为1000~3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃左右使之溶解，然后与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外光照射3min左右，即可交联固定化，然后在无菌条件下，切成一定形状。
光交联树脂包埋法制备固定化酶和固定化细胞是行之有效的方法，通过选择不同分子量的预聚物可以改变聚合而成的树脂孔径，适合于多种不同直径的酶分子和细胞的固定化；光交联树脂的强度高，可连续使用较长时间；用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短，对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有明显的影响。
2. 半透膜包埋法
半透膜包埋法是将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径小些，固定化的酶不会从小球中漏出来。但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜，而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物却无法进出。故此，半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。例如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶。过氧化氢酶等。
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。制备时，一般是将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊之中。例如，将欲固定化的酶及亲水性单体溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将这两种不相溶的液体混合在一起，加入乳化剂进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的己二胺与疏水性的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加进吐温—20，使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊型的固定化酶。
利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，便形成微囊型固定化动物细胞。半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变。微囊的直径为1~2mm。其制备过程现在一般采用海藻酸钙—聚赖氨酸包埋技术。操纵时，动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋，制成直径1~2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解，便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。
三、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。
1. 离子键结合法
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE—纤维素、TE—AE—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶等。
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。例如，将处理成—OH-型的DEAE—葡萄糖凝胶加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE—葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处理过的DEAE—葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处理，使之成为—OH型，用无离子水冲洗，再用pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液，在37℃的条件下，让酶慢慢流过离子交换柱，就可制备成固定化氨基酰化酶。此固定化酶用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生产L—氨基酸。
用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失较少，但由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制好pH、离子强度和温度等操作条件。
2. 共价键结合法
通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡萄糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。
酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、羧基。巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。
使载体活法的方法很多，主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等。
（1）重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝基反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，例如，对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应。
R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2→R—O—CH2—C6H4—N+=N+H20
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成。
NaNO2+HCl=HNO2+NACl
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
（2）叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。例如，羧甲基纤维素的叠氮衍生物。
其中，亚硝酸由亚硝酸钠与盐酸反应生成。
羧甲基纤维素的酰肼衍生物可由羧甲基纤维素制备得到。其反应分两步进行，首先是羧甲基纤维素与甲醇反应生成羧甲基纤维素甲酯。
然后羧甲基纤维素甲酯与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物。羧甲基纤维素叠氮衍生物中活泼的叠氮基团可与酶分子中的氨基形成肽键，使酶固定化。
此外叠氮基团还可以与酶分子中的羟基和巯基等反应，而制成固定化酶。
（3）溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶和葡萄糖凝胶等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。
活化载体上的亚氨基碳酸基团在微碱性的条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。
（4）烷基化法：含羟基的载体可用三氯—均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。
活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基和羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。
用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操纵复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性，现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶。偶联凝胶有多种型号，如溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B，活化羧基琼脂糖凝胶4B等等，在实际应用时，选择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简便地制备固定化酶。在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使用条件，另一方面要了解酶的结构特点，要避免酶活性中心上的基因被偶联而引起失活，也要注意酶在与载体偶联后可能引起酶活性中心的构象变化而影响酶的催化能力。
四、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。
用戊二醛交联时采用的pH一般与被交联的酶或蛋白质的等电点相同。
交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基因被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方法广泛采用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。
五、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60~65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。
固定化技术的应用
随着固定化技术的发展，固定化技术已经医药、食品、轻工、环保及化合物分离纯化等方面广泛应用，主要包括：
1. 通过固定化技术制备固定化酶，在医药、食品、轻工、环保等领域广泛应用。
2. 通过固定化技术制备固定化微生物细胞、固定化动物细胞、固定化植物细胞和固定化原生质体，用于酶、色素、香精、药物、疫苗、抗体、激素等各种物质的生产。
3. 通过固定化技术将母体与配基结合，制备亲和层析剂，用于化合物的亲和层析分离等。
一、固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特点，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点。
（1）酶的稳定性增加，减少温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。
（2）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
（3）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。
故此，固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。这里主要介绍固定化酶在工业生产以及酶传感器方面的应用。
1. 固定化酶在工业生产中的应用
现已用于工业化生产的固定化酶主要有下列几种：
（1）氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE—葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，
固定化酶的特性
将酶固定化制成固定化酶以后，可以基本保持酶的空间结构和活性中心的完整性，所以能够在一定的空间范围内进行催化反应，但是由于受到载体的影响，酶的结构发生了某些改变，从而使酶的催化特性发生某些变化。
在固定化酶使用过程中必须了解其特性并对操纵条件加以适当的调整。现将固定化酶的主要特性介绍如下。
一、稳定性
固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：
1. 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。
2. 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。
3. 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
4. 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。
二、最适温度
固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。例如，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5~10℃；以公家结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5~15℃。同一种酶，在采用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度比游离酶的最适温度提高12℃；用DEAE-纤维素固定化的氨基酰化酶，其最适温度比游离酶提高7℃；而烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。由此可见，固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响，在使用时要加以注意。
三、最适pH
酶经过固定化后，其作用的最适pH往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。
1. 载体性质对最适pH的影响
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。一般说来，用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH高；用带正电荷的载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶的最适pH低；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。
2. 产物性质对最适pH的影响
酶催化作用的产物的性质对固定化酶的最适pH有一定的影响。一般说来，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH低一些；产物为中性时，最适pH一般不改变。这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的pH，为此，固定化酶的最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH要低一些。
四、底物特异性
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。对于那些作用于小分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固定化酶的底物特异性与游离酶的底物特异性相同。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。例如，胰蛋白酶既可作用于大分子的蛋白质，又可作用于小分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右；以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的50%~60%。
固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而相对分子质量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。
酶固定化方法
固定化方法多种多样，主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等，这些方法都可以用于固定化酶的制备，固定化细胞通常采用吸附法或包埋法制备，原生质体固定化一般只采用包埋法制备，现分述如下。
一、吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使其固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。可以根据酶或细胞的特点，载体来源和价格，固定化技术的难度，固定化酶或细胞的使用要求等进行选择。
例如，酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多孔陶瓷和多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域广泛使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，以降低废水中的化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可吸附缠绕在多孔塑料、金属丝网等载体上，用以生产某些有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢；动物细胞大多数属于贴壁细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质的生产。
大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。此法操纵简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空纤维等。
转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操纵容易，但比表面积较小，细胞的生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，从而提高生成能力。
微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100~200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡萄糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。自1967年，Wezel首先以DEAE—Sephadex制成微载体以来，这方面的研究和应用迅速发展。现在国际上已有多种商品微载体出售，例如瑞典的Cytodex、美国的Superbeads和Veltragel等。
微载体已用于多种动物细胞的固定化。用于生产β—干扰素、人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。
微载体具有很大的比表面积，S/V达到150，即每1cm3的微载体其表面积达到150cm2，比转瓶的比表面积打几百倍，对细胞的生长和物质传统非常有利。缺点是固定化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。
中空纤维由聚丙烯、规划聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁，培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空纤维起着相当于体内微血管的作用，对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜。字1972年Knazek首先研制成功中空纤维培养器，用于动物细胞固定化以来，已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化，以生产各种单克隆抗体和疫苗等。中空纤维培养器的缺点是中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物细胞附着，也适用于悬浮细胞培养。
吸附法制备固定化植物细胞，是将植物吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用中空纤维制备固定化植物细胞和动物细胞，有利于动植物细胞的生长和代谢，具有较好的应用前景，但成本较高而且难于大规模生产应用。采用吸附法制备固定化酶活固定化细胞，操纵简便，条件温和，不会引起酶或细胞变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶或细胞与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用后受到一定的限制。
二、包埋法
将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法称为包埋法。
包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。
1. 凝胶包埋法
以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法称为凝胶包埋法。
凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法，适用于多种酶、微生物、动物细胞、植物细胞和原生质体的固定化。
酶分子的直径一般只有几十埃，为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄露出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物向外扩散都是不利的。所以凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。而在细胞核原生质体固定化中，凝胶包埋法是应用最广的方法。各种凝胶由于特性不同，它们的具体包埋方法和包埋条件也不一样。
凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。现把一些主要凝胶的包埋方法介绍如下：
（1）琼脂凝胶包埋法：将一定量的琼脂加到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55℃，加入一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热将混悬液分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化胶粒，分离后洗净备用。也可将混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化胶层切成所需的形状。由于琼脂凝胶的机械强度较差，而且氧气、底物和产物的扩散较困难，故其使用受到限制。
（2）海藻酸钙凝胶包埋法：称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化胶粒。
用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产研究。作者等人用4%的海藻酸钠溶液与等体积的黑曲霉袍子悬液混合，滴到1%的氯化钙溶液中，制成直径约1mm的固定化黑曲霉细胞，用于糖化酶的发酵生产，取得显著效果，糖化酶的产率比游离细胞高30%，固定化细胞可连续使用30天。
海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操纵简便，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。但磷酸盐会破坏凝胶结构，在使用时应控制好培养基中磷酸盐的浓度，并要在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。
（3）角叉菜胶包埋法：将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解、灭菌后，冷却至35~50℃，与一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液混匀，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中，制成小球状固定化胶粒。也可按需要制成片状或其他形状。
角叉菜胶还可以用钾离子以外的其他阳离子，如铵离子、钙离子等，使之凝聚成型。
角叉菜胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定。
角叉菜胶包埋法操纵简便，对酶、细胞核原生质体无毒害，通透性能较好，是一种良好的固定化载体。自1977年以来，在固定化细胞核固定化菌体方面方法应用。坐着等人采用角叉菜胶为载体，制备固定化枯草杆菌细胞，用于连续生产α—淀粉酶的研究，取得可喜成果。
（4）名叫包埋法：配制一定浓度的明胶悬浮液，加热溶化、灭菌后，冷却至35℃以上，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，冷却凝聚后做成所需形状。若机械强度不够时，可用戊二醛等双功能试剂交联强化。由于明胶是一种蛋白质，明胶包埋法不适用于蛋白酶以及产生蛋白酶的细胞和原生质体的固定化。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法：先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀 ，然后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合，获得所需形状的固体化胶粒。
（6）光交联树脂包埋法：选用一定分子量的光交联树脂预聚物，例如相对分子质量为1000~3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃左右使之溶解，然后与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外光照射3min左右，即可交联固定化，然后在无菌条件下，切成一定形状。
光交联树脂包埋法制备固定化酶和固定化细胞是行之有效的方法，通过选择不同分子量的预聚物可以改变聚合而成的树脂孔径，适合于多种不同直径的酶分子和细胞的固定化；光交联树脂的强度高，可连续使用较长时间；用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短，对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有明显的影响。
2. 半透膜包埋法
半透膜包埋法是将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径小些，固定化的酶不会从小球中漏出来。但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜，而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物却无法进出。故此，半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。例如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶。过氧化氢酶等。
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。制备时，一般是将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊之中。例如，将欲固定化的酶及亲水性单体溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将这两种不相溶的液体混合在一起，加入乳化剂进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的己二胺与疏水性的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加进吐温—20，使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊型的固定化酶。
利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，便形成微囊型固定化动物细胞。半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变。微囊的直径为1~2mm。其制备过程现在一般采用海藻酸钙—聚赖氨酸包埋技术。操纵时，动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋，制成直径1~2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解，便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。
三、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。
1. 离子键结合法
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE—纤维素、TE—AE—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶等。
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。例如，将处理成—OH-型的DEAE—葡萄糖凝胶加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE—葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处理过的DEAE—葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处理，使之成为—OH型，用无离子水冲洗，再用pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液，在37℃的条件下，让酶慢慢流过离子交换柱，就可制备成固定化氨基酰化酶。此固定化酶用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生产L—氨基酸。
用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失较少，但由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制好pH、离子强度和温度等操作条件。
2. 共价键结合法
通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡萄糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。
酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、羧基。巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。
使载体活法的方法很多，主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等。
（1）重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝基反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，例如，对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应。
R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2→R—O—CH2—C6H4—N+=N+H20
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成。
NaNO2+HCl=HNO2+NACl
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
（2）叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。例如，羧甲基纤维素的叠氮衍生物。
其中，亚硝酸由亚硝酸钠与盐酸反应生成。
羧甲基纤维素的酰肼衍生物可由羧甲基纤维素制备得到。其反应分两步进行，首先是羧甲基纤维素与甲醇反应生成羧甲基纤维素甲酯。
然后羧甲基纤维素甲酯与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物。羧甲基纤维素叠氮衍生物中活泼的叠氮基团可与酶分子中的氨基形成肽键，使酶固定化。
此外叠氮基团还可以与酶分子中的羟基和巯基等反应，而制成固定化酶。
（3）溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶和葡萄糖凝胶等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。
活化载体上的亚氨基碳酸基团在微碱性的条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。
（4）烷基化法：含羟基的载体可用三氯—均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。
活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基和羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。
用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操纵复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性，现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶。偶联凝胶有多种型号，如溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B，活化羧基琼脂糖凝胶4B等等，在实际应用时，选择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简便地制备固定化酶。在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使用条件，另一方面要了解酶的结构特点，要避免酶活性中心上的基因被偶联而引起失活，也要注意酶在与载体偶联后可能引起酶活性中心的构象变化而影响酶的催化能力。
四、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。
用戊二醛交联时采用的pH一般与被交联的酶或蛋白质的等电点相同。
交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基因被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方法广泛采用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。
五、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60~65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。
固定化技术的应用
随着固定化技术的发展，固定化技术已经医药、食品、轻工、环保及化合物分离纯化等方面广泛应用，主要包括：
1. 通过固定化技术制备固定化酶，在医药、食品、轻工、环保等领域广泛应用。
2. 通过固定化技术制备固定化微生物细胞、固定化动物细胞、固定化植物细胞和固定化原生质体，用于酶、色素、香精、药物、疫苗、抗体、激素等各种物质的生产。
3. 通过固定化技术将母体与配基结合，制备亲和层析剂，用于化合物的亲和层析分离等。
一、固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特点，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点。
（1）酶的稳定性增加，减少温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。
（2）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。
（3）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。
故此，固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。这里主要介绍固定化酶在工业生产以及酶传感器方面的应用。
1. 固定化酶在工业生产中的应用
现已用于工业化生产的固定化酶主要有下列几种：
（1）氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE—葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，
固定化酶的特性
将酶固定化制成固定化酶以后，可以基本保持酶的空间结构和活性中心的完整性，所以能够在一定的空间范围内进行催化反应，但是由于受到载体的影响，酶的结构发生了某些改变，从而使酶的催化特性发生某些变化。
在固定化酶使用过程中必须了解其特性并对操纵条件加以适当的调整。现将固定化酶的主要特性介绍如下。
一、稳定性
固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：
1. 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。
2. 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。
3. 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
4. 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。
二、最适温度
固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。例如，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高5~10℃；以公家结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高5~15℃。同一种酶，在采用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度比游离酶的最适温度提高12℃；用DEAE-纤维素固定化的氨基酰化酶，其最适温度比游离酶提高7℃；而烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。由此可见，固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响，在使用时要加以注意。
三、最适pH
酶经过固定化后，其作用的最适pH往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。
1. 载体性质对最适pH的影响
载体的性质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响。一般说来，用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH高；用带正电荷的载体制备的固定化酶，最适pH比游离酶的最适pH低；而用不带电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。
2. 产物性质对最适pH的影响
酶催化作用的产物的性质对固定化酶的最适pH有一定的影响。一般说来，催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶的最适pH低一些；产物为中性时，最适pH一般不改变。这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的pH，为此，固定化酶的最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH要低一些。
四、底物特异性
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。对于那些作用于小分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶等，固定化酶的底物特异性与游离酶的底物特异性相同。而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。例如，胰蛋白酶既可作用于大分子的蛋白质，又可作用于小分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%左右；以羧甲基纤维素为载体经叠氮法制备的核糖核酸酶，当以核糖核酸为底物时，催化速度仅为游离酶的2%左右，而以环化鸟苷酸为底物时，催化速度可达游离酶的50%~60%。
固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而相对分子质量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。
酶固定化方法
固定化方法多种多样，主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等，这些方法都可以用于固定化酶的制备，固定化细胞通常采用吸附法或包埋法制备，原生质体固定化一般只采用包埋法制备，现分述如下。
一、吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使其固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。
物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。可以根据酶或细胞的特点，载体来源和价格，固定化技术的难度，固定化酶或细胞的使用要求等进行选择。
例如，酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多孔陶瓷和多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域广泛使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，以降低废水中的化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可吸附缠绕在多孔塑料、金属丝网等载体上，用以生产某些有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢；动物细胞大多数属于贴壁细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白质的生产。
大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。此法操纵简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空纤维等。
转瓶是由玻璃或塑料制成，表面经过一定方法处理而带上电荷。如用高锰酸钾等氧化剂、强酸、强碱或紫外光照射等进行表面处理，就可使动物细胞容易附着在其表面生长。培养时，转瓶以一定速度转动。转瓶培养的设备简单，操纵容易，但比表面积较小，细胞的生长繁殖受到限制。若在转瓶内加进列管或多层平板组成列管式转瓶或多层平板式转瓶即可使其比表面积增加，从而提高生成能力。
微载体是指颗粒细小的固定化载体，直径一般为100~200μm，相对密度接近1.0。是由带有表面电荷的葡萄糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。自1967年，Wezel首先以DEAE—Sephadex制成微载体以来，这方面的研究和应用迅速发展。现在国际上已有多种商品微载体出售，例如瑞典的Cytodex、美国的Superbeads和Veltragel等。
微载体已用于多种动物细胞的固定化。用于生产β—干扰素、人组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素以及各种疫苗等。
微载体具有很大的比表面积，S/V达到150，即每1cm3的微载体其表面积达到150cm2，比转瓶的比表面积打几百倍，对细胞的生长和物质传统非常有利。缺点是固定化细胞的强度不够，容易破碎，使用时间较短。
中空纤维由聚丙烯、规划聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纤维管壁是半透膜。使用时，将动物细胞置于纤维管外壁和外壳容器的内壁之间，细胞附着在中空纤维外壁，培养液在中空纤维管内流动，各种营养成分、溶解氧和代谢产物透过中空纤维膜进行传递。这种固定化细胞与动物体内细胞的存活方式类似，中空纤维起着相当于体内微血管的作用，对动物细胞的生长和新陈代谢非常适宜。字1972年Knazek首先研制成功中空纤维培养器，用于动物细胞固定化以来，已有多种中空纤维培养器用于动物细胞固定化，以生产各种单克隆抗体和疫苗等。中空纤维培养器的缺点是中空纤维成本较高，有时会发生纤维管堵塞现象，大规模生产的难度较大。中空纤维固定化适用于动物细胞附着，也适用于悬浮细胞培养。
吸附法制备固定化植物细胞，是将植物吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁。用中空纤维制备固定化植物细胞和动物细胞，有利于动植物细胞的生长和代谢，具有较好的应用前景，但成本较高而且难于大规模生产应用。采用吸附法制备固定化酶活固定化细胞，操纵简便，条件温和，不会引起酶或细胞变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶或细胞与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用后受到一定的限制。
二、包埋法
将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法称为包埋法。
包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。
1. 凝胶包埋法
以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法称为凝胶包埋法。
凝胶包埋法是应用最广泛的固定化方法，适用于多种酶、微生物、动物细胞、植物细胞和原生质体的固定化。
酶分子的直径一般只有几十埃，为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄露出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物向外扩散都是不利的。所以凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。而在细胞核原生质体固定化中，凝胶包埋法是应用最广的方法。各种凝胶由于特性不同，它们的具体包埋方法和包埋条件也不一样。
凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。现把一些主要凝胶的包埋方法介绍如下：
（1）琼脂凝胶包埋法：将一定量的琼脂加到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55℃，加入一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热将混悬液分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化胶粒，分离后洗净备用。也可将混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化胶层切成所需的形状。由于琼脂凝胶的机械强度较差，而且氧气、底物和产物的扩散较困难，故其使用受到限制。
（2）海藻酸钙凝胶包埋法：称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中，形成球状固定化胶粒。
用海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产研究。作者等人用4%的海藻酸钠溶液与等体积的黑曲霉袍子悬液混合，滴到1%的氯化钙溶液中，制成直径约1mm的固定化黑曲霉细胞，用于糖化酶的发酵生产，取得显著效果，糖化酶的产率比游离细胞高30%，固定化细胞可连续使用30天。
海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操纵简便，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。但磷酸盐会破坏凝胶结构，在使用时应控制好培养基中磷酸盐的浓度，并要在培养基中保持一定浓度的钙离子，以维持凝胶结构的稳定性。
（3）角叉菜胶包埋法：将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解、灭菌后，冷却至35~50℃，与一定量的酶、细胞或原生质体悬浮液混匀，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中，制成小球状固定化胶粒。也可按需要制成片状或其他形状。
角叉菜胶还可以用钾离子以外的其他阳离子，如铵离子、钙离子等，使之凝聚成型。
角叉菜胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低，强度不够时，可用戊二醛等交联剂再交联处理，进行双重固定。
角叉菜胶包埋法操纵简便，对酶、细胞核原生质体无毒害，通透性能较好，是一种良好的固定化载体。自1977年以来，在固定化细胞核固定化菌体方面方法应用。坐着等人采用角叉菜胶为载体，制备固定化枯草杆菌细胞，用于连续生产α—淀粉酶的研究，取得可喜成果。
（4）名叫包埋法：配制一定浓度的明胶悬浮液，加热溶化、灭菌后，冷却至35℃以上，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，冷却凝聚后做成所需形状。若机械强度不够时，可用戊二醛等双功能试剂交联强化。由于明胶是一种蛋白质，明胶包埋法不适用于蛋白酶以及产生蛋白酶的细胞和原生质体的固定化。
（5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法：先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液，与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀 ，然后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合，获得所需形状的固体化胶粒。
（6）光交联树脂包埋法：选用一定分子量的光交联树脂预聚物，例如相对分子质量为1000~3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃左右使之溶解，然后与一定浓度的酶、细胞或原生质体悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外光照射3min左右，即可交联固定化，然后在无菌条件下，切成一定形状。
光交联树脂包埋法制备固定化酶和固定化细胞是行之有效的方法，通过选择不同分子量的预聚物可以改变聚合而成的树脂孔径，适合于多种不同直径的酶分子和细胞的固定化；光交联树脂的强度高，可连续使用较长时间；用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短，对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有明显的影响。
2. 半透膜包埋法
半透膜包埋法是将酶或细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。
半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径小些，固定化的酶不会从小球中漏出来。但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜，而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物却无法进出。故此，半透膜包埋法适用于底物和产物都是小分子物质的酶的固定化。例如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶。过氧化氢酶等。
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。制备时，一般是将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊之中。例如，将欲固定化的酶及亲水性单体溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将这两种不相溶的液体混合在一起，加入乳化剂进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的己二胺与疏水性的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加进吐温—20，使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊型的固定化酶。
利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，便形成微囊型固定化动物细胞。半透膜的孔径可以根据需要加以控制和改变。微囊的直径为1~2mm。其制备过程现在一般采用海藻酸钙—聚赖氨酸包埋技术。操纵时，动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋，制成直径1~2mm的胶粒，再用聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜，然后将它泡在柠檬酸钠溶液中，使海藻酸钙凝胶溶解，便获得由聚赖氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。
三、结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。
1. 离子键结合法
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE—纤维素、TE—AE—纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶等。
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。只需在一定的pH、温度和离子强度等条件下，将酶液与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱就可使酶结合在离子交换剂上，制备得到固定化酶。例如，将处理成—OH-型的DEAE—葡萄糖凝胶加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE—葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处理过的DEAE—葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处理，使之成为—OH型，用无离子水冲洗，再用pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液，在37℃的条件下，让酶慢慢流过离子交换柱，就可制备成固定化氨基酰化酶。此固定化酶用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生产L—氨基酸。
用离子键结合法制备的固定化酶，活力损失较少，但由于通过离子键结合，结合力较弱，酶与载体的结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。所以用离子结合法制备的固定化酶，在使用时一定要严格控制好pH、离子强度和温度等操作条件。
2. 共价键结合法
通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡萄糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。
酶分子中可以形成共价键的基团主要有氨基、羧基。巯基、羟基、酚基和咪唑基等。
要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。
使载体活法的方法很多，主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等。
（1）重氮法：将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝基反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，例如，对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应。
R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2→R—O—CH2—C6H4—N+=N+H20
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成。
NaNO2+HCl=HNO2+NACl
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。
（2）叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。例如，羧甲基纤维素的叠氮衍生物。
其中，亚硝酸由亚硝酸钠与盐酸反应生成。
羧甲基纤维素的酰肼衍生物可由羧甲基纤维素制备得到。其反应分两步进行，首先是羧甲基纤维素与甲醇反应生成羧甲基纤维素甲酯。
然后羧甲基纤维素甲酯与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物。羧甲基纤维素叠氮衍生物中活泼的叠氮基团可与酶分子中的氨基形成肽键，使酶固定化。
此外叠氮基团还可以与酶分子中的羟基和巯基等反应，而制成固定化酶。
（3）溴化氰法：含有羟基的载体，如纤维素、琼脂糖凝胶和葡萄糖凝胶等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物。
活化载体上的亚氨基碳酸基团在微碱性的条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。
（4）烷基化法：含羟基的载体可用三氯—均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。
活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基和羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。
用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操纵复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象，从而影响酶的催化活性，现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶。偶联凝胶有多种型号，如溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B，活化羧基琼脂糖凝胶4B等等，在实际应用时，选择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简便地制备固定化酶。在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使用条件，另一方面要了解酶的结构特点，要避免酶活性中心上的基因被偶联而引起失活，也要注意酶在与载体偶联后可能引起酶活性中心的构象变化而影响酶的催化能力。
四、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。
用戊二醛交联时采用的pH一般与被交联的酶或蛋白质的等电点相同。
交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基因被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重固定化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方法广泛采用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。
五、热处理法
将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60~65℃的温度下处理15min，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理也可与交联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。
